Apidologie 38 (2007) 390-410
Доступно онлайн: c INRA/DIB-AGIB/ EDP Sciences, 2007www.api dologie.org DOI: 10.1051/apido:2007029
.6. Последствия обработки и хранения спермы
Сперматозоиды остаются жизнеспособными в сперматеке королевы в течение нескольких лет. Спермацетовая жидкость содержит белки, сахара и антиокс-иданты, а окружающая трахейная сеть обеспечивает кислород (Koeniger, 1986; Phiancharoen et al., 2004). Физикохимические свойства разбавителей; pH, осмолярность и питательные вещества, а также методы обработки могут повысить или снизить выживаемость сперматозоидов (Verma, 1978; Moritz, 1984; Harbo, 1986b; Collins, 2000a). Используемый разбавитель имеет более важное значение при разбавлении, смешивании или хранении се- мен. Рекомендуется использовать раствор Tris buffer с pH 8,5, который содержит сахара, аминокислоты и антибиотик (Moritz, 1984). Богатая питательными веществами зеленая кокосовая вода также дает хорошие результаты (Almeida and Soares, 2002). Для разработки разбавителя, способствующего улучшению качества и здоровья спермы, необходимы дальнейшие поиски. Сперма медоносных пчел может храниться в герметичных пробирках в течение нескольких недель при комнатной температуре с хорошим успехом. Альмейда и Соарес (2002) не наблюдали значительной смертности спермы, разбавленной зеленой кокосовой водой и хранившейся в пробирках. в течение двух недель. Locke и Peng (1993) показали, что первоначальная жизнеспособность 87% снизилась до 78% после 6 недель хранения. Collins (2000b) сообщил о 70%-80% жизнеспособности спермы, разбавленной Tris buffer и хранившейся при комнатной температуре, 25 ◦ C, или в холодильнике при 12 ◦ C до 6 недель. Skowronek и Konopacka (1983) сообщили об аналогичных результатах исследования спермы, хранившейся при 12 ◦ С в течение 3 и 6 недель. Температура является важным фактором для кратковременного хранения спермы in vitro. Оптимальная температура составляет 21◦ C, в диапазоне от 13 до 25◦ C (Harbo and Williams, 1987; Locke and Peng, 1993; Konopacka and Bienkowska, 1995). Температура ниже 10◦ С или выше 32◦ С, а также воздействие солнечного света приводят к плохому успеху (Taber and Blum, 1960; Harbo and Williams, 1987). Практика смешивания спермы от ну- меровых трутней механически или путем центрифугирования выгодна для целей разведения. Хвосты сперматозоидов длинные, хрупкие, и их обработка снижает жизнеспособность (Collins, 2003, неопубликованные данные). Несколько исследований показали, что королевы, осемененные разбавленной, смешанной и восстановленной спермой, медленнее начинали яйцекладку и сохраняли меньше сперматозоидов по сравнению с королевами, осемененными свежей, цельной спермой (Kaftanoglu and Peng, 1980, 1982; Moritz, 1983; Skowronek and Konopacka, 1983). Lodesani et al. (2004) сообщили, что при перемешивании и пипетировании, а не центрифугировании, смешивание спермы было более эффективным и повторно ответственным, хотя королевы должны быть осеменены двумя 8 мкл спермы в соотношении 1:1 сперма/разбавитель. Хотя королевы, осемененные смешанной спермой, могут хранить меньше сперматозоидов, они способны возглавлять продуктивные колонии. Коллинз (2000a) и Лодесани и др. (2004) показали, что сперматозоиды отбираются по качеству во время миграции в сперматофор. Королевы, осемененные 50% живых и 50% мертвых сперматозоидов, дали жизнеспособных маток (Collins, 2000a). Подвижность, которая ранее считалась характеристикой для измерения качества спермы, не является точным показателем (Collins, 2006). Несколько исследований показали, что выживаемость маток, осемененных смешанной спермой, была такой же, как и маток, осемененных цельной спермой (Kühnert et al., 1989; Harbo, 1990). В исследовании Кюнерта и др. сперма была разбавлена, центрифугирована и восстановлена, а в исследовании Харбо сперма была разбавлена 1:1 и механически перемешана. Янке (неопубликованные данные) утверждает, что из 150-250 маток, производимых ежегодно в течение пятнадцати лет и осеменяемых разбавленной, центрифугированной и восстановленной спермой, многие матки плодовиты в течение года, а некоторые - до трех лет. Длительное хранение спермы с использованием методов цироконсервации возможно, хотя все еще находится на экспериментальной стадии. Были достигнуты успехи в хранении в жидком азоте с использованием различных циропротекторов, таких как ДМСО, (диметилсульфоксид) и глицерин, причем ДМСО дает наилучшие результаты (Harbo, 1979a). Критическими переменными являются скорость замораживания и оттаивания и используемый разбавитель. Харбо (Harbo, 1979b) сообщил, что королевы, осемененные спермой, хранившейся в жидком азоте, дали рабочее потомство, хотя многие королевы дали больше трутней, чем рабочего расплода, а скорость вылупления яиц была ниже по сравнению с контролем. Также сообщалось о возможном генетическом повреждении в последующих поколениях (Harbo, 1981). Необходимы дальнейшие исследования для разработки методов долгосрочного хранения зародышевой плазмы медоносных пчел.
3.7. Последствия обработки углекислым газом
Обработка углекислым газом, используемая для обезболивания королевы во время процедуры осеменения, также имеет благоприятный эффект, вызывая откладку яиц. Обработка СО 2стимулирует нейросекреторную выработку ювенильного гормона, который способствует началу яйцекладки (Mackensen, 1947). Два метода обработки СО2 стимулируют молодых IIQ к началу яйцекладки в тот же период времени, что и NMQ. Одна обработка проводится во время процедуры, другая - до или после осеменения. Время и дозировка обработки СО 2варьируются на практике и могут влиять на производительность королевы. Маккенсен (1947) сообщил, что у IIQ, не прошедших вторую обработку СО2, начало откладки яиц задерживается на 40-60 дней. Хотя, Войке (1966) сообщил, что IIQ начали откладывать яйца через 8-12 дней без второй обработки CO 2 лечения. Он объясняет это более старшим возрастом маток на момент осеменения, который составлял от 8 до 12 дней по сравнению с 3-7 днями в исследовании Маккенсена. Харбо (1986b) также утверждает, что старые девственные королевы, хранящиеся в банке в течение 2 месяцев до осеменения, не нуждаются во второй обработке СО2, чтобы вызвать откладку яиц. Девственные королевы этого возраста часто откладывают яйца в клетках. Влияние обработки углекислым газом на маток до конца не изучено. У рабочих пчел, подвергшихся воздействию СО, 2сокращается продолжительность жизни (Austin, 1955) и изменяется поведение (Skowronek and Jaycox, 1974). Известно, что воздействие СО 2на девственных маток ингибирует брачные полеты маток, вызывает снижение веса и уменьшает или задерживает выработку феромонов матками (Harbo, 1986b; Woyke. et al., 1995). Skowronek (1976) сообщил, что двухдневные королевы, анестезированные CO2 в течение 10-30 минут, задерживали свои брачные полеты от 9 до 25 дней, по сравнению с необработанными королевами, которые летали на 6-й день после появления. Обработанные королевы также совершали меньше полетов и хранили меньше сперматозоидов. Woyke et al. (1995) также исследовали ингибирование брачных полетов королевами, осемененными в разном возрасте, при различной 2обработке СО. В серии исследований они продемонстрировали, что два осеменения или две обработки СО2 предотвращают спаривание, когда королевам разрешен свободный полет. Возраст маток на момент осеменения был фактором, способствующим этому. По мере увеличения возраста маток при осеменении 8 мкл с 6 до 14 дней, процент естественного спаривания снизился с 69% до 29%. Кроме того, королевы не спаривались естественным образом при обработке СО 2за два дня до осеменения 8 мкл и при двукратном осеменении 4 мкл спермы. Из королев, осемененных 8 мкл спермы и получивших две обработки СО через 2два дня после осеменения, 14% спарились естественным путем (Woyke et al., 2001). Из маток, осемененных одной дозой 8 мкл спермы и не получивших второй обработки СО2, 61% спаривались естественным путем (Woyke et al., 1995). Harbo и Szabo (1984) сообщили, что обработка СО2 вызывает начальную потерю веса у маток, как IIQ, так и NMQ, через 3-9 дней после начала откладки яиц. Матки NMQ были тяжелее и откладывали больше яиц в день, чем IIQ. Нельсон и Laidlaw (1988) также сообщили о потере веса IIQ в начале откладки яиц, NMQ в среднем составляли 190 мг, а IIQ - 174 мг. Однако через 2 месяца обе группы маток были схожи по весу и производству расплода. Они объяснили первоначальное различие в весе тем, что IIQ не начали откладывать яйца, в то время как NMQ откладывали их до введения в колонию. Jasnousek (1987) сообщил, что сокращение времени обработки СО2 с 10 до 1 минуты не оказало никакого влияния на начало яйцекладки маток. Однако Конопацкая (1991) заявила, что королевы, получившие две 10-минутные обработки, отложили яйца раньше, через 7-8 дней, по сравнению с королевами, получившими две 3-минутные обработки, которые начали откладывать яйца через 15 дней. Эти различия могут быть обусловлены другими факторами, такими как возраст маток и сезонные условия. Konopacka (1987) объясняет сокращение продолжительности жизни IIQ чрезмерным воздействием CO2, однако это наблюдалось только после третьего года производства. Королевы, получившие две сильные десятиминутные 2обработки CO, прожили более короткую жизнь по сравнению с теми, кто получил слабую, неполную анестезию продолжительностью менее одной минуты, при которой королева продолжала двигаться брюшком. Несколько исследований предлагают практические рекомендации. Fischer (1990) показал, что миграция сперматозоидов происходит более эффективно у маток, которых обработали СО 2за день до осеменения, а не на следующий день после процедуры. Миграция сперматозоидов занимает около двух дней, и 2воздействие СО в течение этого времени может прервать или замедлить миграцию и охладить маток. 2Обработка СО перед осеменением также препятствует естественным брачным полетам и необходимости закрывать входы в нуклеусы (Woyke et al., 2001). Ebadi и Gary (1980) показали, что обработка СО2, разбавленным воздухом, вызывает более раннее яйцекладение IIQ, и предлагают использовать 75%-ный CO 2. смесь.
3.8. Разработка феромонов и принятие королевы
Королева претерпевает множество изменений в физиологии и поведении: от новоявленной девственницы до брачного возраста, спаривания, созревания и производства яиц. Состав феромона королевы резко меняется между девственными и спаренными королевами. Количественные и качественные изменения зависят от ста- туса королевы и являются уникальными для каждой особи (Apoe- gait and Skirkevicius, 1995). Эти сложные химические смеси передают репродуктивный статус матки, поддерживают социальную сплоченность, вызывают ответную реакцию и влияют на поведение и физиологию рабочих пчел. Развитие феромонов может быть задержано в IIQ по сравнению с NMQ и объясняет, почему принятие IIQ иногда может быть более сложным. Рабочие пчелы менее внимательны к молодым, девственным королевам по сравнению с откладывающими королевами. Наличие, концентрация и пропорции феромона мандибулярной железы матки (QMP) зависят от возраста, репродуктивного статуса, генетического состава и сезонных изменений (Pankiw, 2004) QMP, вырабатываемый молодыми девственными матками до спаривания в возрасте от 1 до 2 дней, отличается от QMP, вырабатываемого девственными матками в возрасте спаривания от 4 до 7 дней, и отличается от QMP, вырабатываемого матками, откладывающими яйца. Зрелые, спаренные королевы имеют высокий уровень QMP по сравнению с недавно спаренными и девственными королевами (Slessor et al., 1988, 1990). Pankiw и др. (1996) обнаружили, что молодые, не спаренные королевы производят меньшее количество и разное соотношение компонентов QMP по сравнению со спаренными королевами. Было показано, что королевы, откладывающие трутней, имеют промежуточное количество по сравнению со спаренными и девственными королевами. Производство феромонов является сложным и не зависит только от возраста. Richard et al. (2005) предполагает, что степень спаривания королев также может влиять на различия между профилями феромонов. В предварительных исследованиях многократно спаривавшиеся королевы привлекали больший ответ сетчатки, чем однократно спаривавшиеся королевы. Другой источник феромона королевы - выделения тергаловых желез (TGS), локализованные на дорсальной поверхности брюшка, - играет определенную роль во взаимодействии рабочих и королевы. Рабочие во дворе королевы активно облизывают и ощупывают дорсальное брюшко королевы. Смесь TGS и QMP поддерживает и стабилизирует поведение свиты и сообщает рабочим, что королева спарилась (Slessor et al., 1988). TGS обнаруживаются у зрелых маток и меняются в зависимости от возраста. Молодые девственные королевы не производят TGS до брачного возраста 5-10 дней. НМК в возрасте 10 дней или через 48 часов после спаривания продуцируют полный набор TGS. Производство TGS стимулируется брачными полетами, а не инструментальным осеменением. Было показано, что у девственных королев и IIQ, лишенных возможности совершать брачные полеты, производство TGS начинается с задержкой, примерно через 40 дней после появления. Хотя не было обнаружено различий в начале производства TGS между IIQ и сестринскими девственными королевами (Smith et al., 1991, 1993). Различия в скорости развития феромонных смесей IIQs и NMQs могут влиять на первоначальное принятие королевы. NMQ могут вызывать более высокую реакцию и уровень принятия, по сравнению с IIQ. Отсутствие брачного полета и обработка маток, осемененных в разном возрасте и хранящихся в банках в течение разного периода времени, могут повлиять на скорость и состав смеси феромонов. выработка феромонов королевы. Различия в уровнях феромонов между IIQ и NMQ могут стать менее значительными, когда королевы отложатся и укоренятся. У спарившихся маток профили QMP относительно стабильны с течением времени. Панкив (неопубликованные данные) не обнаружила значительных изменений в количестве или качестве компонентов QMP между откладывающими NMQ и IIQ. Она предполагает, что сигналы расплода являются более "честной" оценкой плодовитости королевы. Рабочие пчелы обнаруживают различные смеси феромонов расплода и взрослых пчел разного возраста. Панкив (неопубликованные данные) предполагает, что рабочие реагируют на изменения в соотношении расплода и взрослых пчел, поскольку это связано с уровнем яйцекладки матки. IIQ уязвимы во время интродукции королевы и раннего становления, то есть в период развития и созревания феромонов, вырабатываемых королевой. Наблюдая за NMQ в возрасте от 7 до 31 дня, Родс и Сомервилл (2003) обнаружили, что уровни феромонов различаются у королев одной и той же возрастной группы. Компоненты из десяти идентифицированных уровней феромонов также различались между возрастными группами. Авторы предполагают связь между уровнем феромонов, принятием королевы и успехом выживания. В другом исследовании Rhodes et al. (2004) повторно показали, что молодые NMQ, которым позволили откладывать яйца в течение нескольких недель в колониях нуклеусов перед их пересадкой в большие колонии, имели более низкий уровень суперседиментации и более высокий уровень выживаемости, по сравнению с королевами, которых держали в клетках и заставляли повторно поглощать яйца во время транспортировки вскоре после начала откладки яиц. Фри и др. (1992) сообщили, что рабочие пчелы уделяют больше внимания маткам, которые спаривались в течение двух месяцев и более. Сложные и меняющиеся смеси феромонов королевы и выводка играют важную роль в принятии и замене королевы. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, влияет ли обработка маток в процессе инструментального осеменения и выращивания на выработку и производство феромонов маток. Однако различия в феромонных смесях между IIQ и NMQ, повидимому, незначительны или, по крайней мере, не имеют значения для производительности маток после их создания.
4. ДИСКУССИЯ
Этот обзор обеспечивает уровень уверенности в использовании IIQ и дает представление о методологии улучшения производительности маток. Результаты различных исследований убедительно показывают, что IIQ способны возглавлять продуктивные колонии и выдерживать жесткие испытания в полевых условиях. Продемонстрированная надежность инструментального осеменения как инструмента для селекции должна способствовать более широкому использованию этой техники в программах разведения пчел и содержания поголовья. Многие факторы влияют на производительность маток. Практика управления пчеловодством и лечение маток, по-видимому, оказывают более значительное влияние на производительность маток, чем сама процедура осеменения. Обработка маток в одном исследовании Группы III, в котором сообщалось о более низкой производительности IIQ, значительно отличалась от исследований Групп I и II, показавших равную или более высокую производительность IIQ (см. табл. I). Обычная практика пчеловодства явно влияет на результаты. Эффективность миграции сперматозоидов снижается, если маток осеменяют позже их восприимчивого брачного возраста, сажают в клетки или содержат при температуре ниже температуры расплодного гнезда. Королевы с недостаточным количеством хранящихся сперматозоидов имеют более низкий уровень выживаемости. Дозировка, качество и обработка спермы, используемой для осеменения, также влияют на результаты. Все эти аспекты можно контролировать и оптимизировать при правильной практике пчеловодства, чтобы повысить производительность IIQ. При создании IIQ могут наблюдаться некоторые первоначальные различия. Брачные полеты и сам акт спаривания могут стимулировать физиологическое развитие, которое может быть медленнее в IIQ по сравнению с NMQ. Эти различия являются незначительными и могут быть сведены к минимуму с помощью правильных процедур осеменения и надлежащего обращения с матерями. Эти различия можно наблюдать во время подсадки маток и они становятся несущественными, когда матки уже сформировались и откладывают яйца. Понимание и внедрение практики пчеловодства, способствующей повышению эффективности IIQ, как это обсуждается в данном обзоре, приведет к получению конкурентоспособных показателей у таких маток по сравнению с NMQ. В большинстве исследований преимущество контролируемого спаривания показывает, что возможность отбора по ценным признакам может привести к более высокой производительности IIQ по сравнению с NMQ. Также известно, что IIQ выживают в течение нескольких лет и превосходят NMQ. Янке (данные не опубликованы) за годы работы пчеловодом на севере Новой Зеландии заметил, что IIQ более постоянны и часто живут дольше, чем NMQ, особенно когда погодные условия в период спаривания менее оптимальны. Это подтверждает мой собственный опыт ежегодного производства нескольких гиндред IIQ для программы разведения с 1981 года по настоящее время. Инструментальное осеменение дает преимущество более равномерного спаривания маток. Обзор коммерческого производства королев в Австралии показал, что количество сперматозоидов у NMQ варьировалось в широком диапазоне (Rhodes and Somerville, 2003). Королевы, спаривающиеся в конце сезона, имели низкое количество сперматозоидов и начинали кладку примерно с 2 миллионами хранящихся сперматозоидов, в то время как среднее количество составляет 5-6 миллионов. Во время пика сезона 42% трутней имели менее 0,5 млн. сперматозоидов, авторы (Rhodes and Somerville, 2003) предполагают, что факторами могут быть недостаточная численность трутней и низкое количество сперматозоидов. Количество сперматозоидов у трутней обычно составляет от 7 до 11 миллионов на особь (Mackensen, 1955; Ruttner and Tryasko, 1976; Woyke, 1989c). Осеменение маток известной и одинаковой дозой спермы исключает широкий диапазон частоты спаривания НМК. Предполагается, что королевы продолжают совершать брачные полеты до тех пор, пока не накопится достаточное количество спермы. Хотя Тарпи и Пейдж (2000) утверждают, что частота спаривания не поддается контролю, и предполагают, что основное влияние оказывают количество доступных трутней, погода и сезонные условия. Возможность увеличить генетическое разнообразие внутри колонии, превышающее то, что возможно при естественном спаривании, является преимуществом инструментального осеменения. Впечатляющее разнообразие признаков и гибкость поведения медоносных пчел обусловлены их внутриколониальной генетической изменчивостью. Генетическое разнообразие повышает приспособленность колонии, позволяя медоносным пчелам осваивать и выживать в широких экологических диапазонах, переносить экстремальные климатические условия и противостоять вредителям и болезням. Несколько исследований показали, что адаптивность, продуктивность и выживаемость, как правило, выше в колониях, скрещенных между собой (Fuchs and Schade, 1994; Palmer and Oldroyd, 2000; Tarpy and Page, 2002). Еще одним преимуществом инструментального осеменения является возможность выделить конкретный признак и устранить сложность генетического фона, который маскирует проявление конкретного признака. С секвенированием генома медоносной пчелы этот метод станет все более ценным для исследований. Применяемое для улучшения поголовья, инструментальное осеменение является важным инструментом для создания товарного поголовья, которое имеет лучшую выживаемость в присутствии паразитических клещей и болезней, а также улучшает такие признаки, как продуктивность, хороший темперамент и способность к зимовке. Данные, представленные в таблице I, убедительно свидетельствуют о том, что инструментальное осеменение является надежным и практичным методом. Однако практика пчеловодства, направленная на снижение трудозатрат, повышение эффективности и удобство планирования, часто создает неоптимальные условия для развития маток и хранения спермы в сперматеке. Более низкие уровни производительности IIQ, вероятно, можно отнести к таким факторам. Имея возможность контролировать спаривание, ИИК, как правило, отбираются на лучшие генотипы, что может скрывать возможные недостатки инструментального осеменения в отношении их производительность. Необоснованную репутацию низкой эффективности IIQ было трудно развеять, хотя научное сообщество неоднократно демонстрировало их равную, а иногда и более высокую эффективность по сравнению с NMQ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Я благодарю Сьюзен Фишер и Тимоти Лоуренса за критический обзор этой рукописи.
С.В. Кобей